銅を含むタンパク質の主な役割は酸化還元機能です。現在知られている、銅を含む酵素の殆どが分子状酸素と直接反応します。プラズマ中の銅のおよそ95％はα-2-グロブリン、セルロプラスミン、フェロキシダーゼ活性を持つ酸化酵素と結合しています。銅の欠乏に関連する病気として、心臓疾患、骨粗しょう症、骨関節炎、Menkes症候群、ウイルソン病などがあります。また、生体内の抗酸化機能の低下についても報告されています。一方、過剰の銅は有毒となります。

本法は3-5 DiBr-PAESAと銅とのキレート錯体形成による可視部の呈色を観測し銅濃度を求めます。 セルロプラスミン、及びタンパク質に結合した銅を、弱酸、変性剤により解離させ、銅-3-5 DiBr-PAESA錯体を形成させます。この銅キレート錯体を波長580nmで測定することにより銅濃度を求めることができます。

◯ 本キットでダイレクトに定量可能な試料 例：血清、血漿 キット中の変性剤が銅をタンパクから解離させ、還元剤によって還元したのち発色させます。特に前処理は必要ありません。 ※EDTAを含む採血管は測定値に影響を与えるので使用しないでください。 ◯ 酸抽出の必要な試料 例：細胞ライセートや組織ホモジネート、その他液状試料 サンプルを低pHにすることでタンパクから銅を解離させ、上清として回収し、アッセイ検体とします。 ただし、測定できるのは以下の化学種に限ります。 ・遊離銅 ・タンパク結合（配位）銅（ Protein-Cu2+ 、 e.g.アルブミン、メタロチオネイン） ・その他、配位結合性銅 ※EDTAを含むLysis bufferは測定値に影響を与えるので使用しないでください。 ※有機銅やヘム銅などは酸分解を行って下さい。 ◯ マイクロウエーブ法及び有機物混酸分解が必要な試料 例：EDTAなどの強固なキレート剤を含む試料、有機銅（ -C-Cu-C- 単結合の場合）、環状配位子内包銅 （Cu-ポルフィリン等）を測定したい試料 酸抽出では解離してこない化学種を測定する場合や、強力な銅キレート剤などの妨害物質を含むサンプルの測定に必要です。 ※各分解法で有機物を分解後、pH2 ~ 3に調整し、定容した試料をアッセイ検体としてください。

(1) DIW、標準液、アッセイ検体 12 µlを96 well plateにアプライ (2) 発色液 240 µlをwell添加 (3) 室温で10分間インキュベート (4) 主波長580 nmの吸光度を測定 (5) 以下の計算式より銅濃度を求める

(1) 本キットによる管理血清の測定 図1. 銅濃度が既知である管理血清の測定結果 (2) 本キットによるブタ肝臓中銅濃度の測定 図2. ICP-OES法と本キットによるブタ肝臓中銅濃度測定結果

Tanaka K et al. Thioredoxin-albumin fusion protein prevents copper enhanced zinc-induced neurotoxicity via its antioxidative activity. Int J Pharm. 2017 Nov. PubMed PMID: 29122608. Horie M et al. Metal Ion Release of Manufactured Metal Oxide Nanoparticles Is Involved in the Allergic Response to Inhaled Ovalbumin in Mice. Occupational Diseases and Environmental Medicine. 2016 May. Furukawa Y et al. Conformational Disorder of the Most Immature Cu, Zn-Superoxide Dismutase Leading to Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Biol Chem. 2016 Feb. PubMed PMID: 26694608. Nakanishi K et al. Synthesis of amino-functionalized mesoporous silica sheets and their application for metal ion capture. Journal of Asian Ceramic Societies. 2014 Nov. Asada N et al. Pheomelanin Formation and Low Tyrosinase Activity in Fading Body Color Variant BdlR Strain Oryzias latipes. J Life Sci. 2014 June. Sakurai Y et al. A primary role for disulfide formation in the productive folding of prokaryotic Cu,Zn-superoxide dismutase. J Biol Chem. 2014 Jul. PubMed PMID: 24917671. Sakamoto A et al. Enhanced biofilm formation and/or cell viability by polyamines through stimulation of response regulators UvrY and CpxR in the two-component signal transducing systems, and ribosome recycling factor. Int J Biochem Cell Biol. 2012 Nov. PubMed PMID:22814172.

岩渕拓也：技術情報協会（編）　微量金属分析とその前処理技術,p192-200(2015) 岩渕拓也、鈴木裕子：技術情報協会（編）　最先端バイオマーカーを用いた診断薬/診断装置開発と薬事対応(2015) 鈴木裕子, 大槻　透, 伊藤奈月, 佐藤文平, 小出和弘, 岩渕拓也, 生体鉄研究に適用できるカラーメトリーアッセイと新規なプローブの活用法, 細胞46(1), 2014.

Abe, A., Yamashita, S., Noma, A., Clin. Chem., 552-554 (1989). Makino T., Kiyonega. Clin. Chem. Acta, 171,19 (1988)

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